High Performance Liquid Chromatography (HPLC)(195,530 views)

คู่มือการใช้เครื่องมือ High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Water model Water 600

HPLC เป็นเทคนิคที่ใช้ในการแยกสารผสมที่อยู่ในสภาวะของเหลว ซึ่งอาศัยความแตกต่างของอัตราการเคลื่อนที่ของสารประกอบที่ผ่านไปในคอลัมน์(เฟสที่อยู่กับที่) โดยการชะหรือการพาของเฟสเคลื่อนที่ จำแนกได้อย่างกว้างตามกลไกการแยกได้ 4 ประเภท ได้แก่

1. Adsorption chromatography
2. Partition chromatography
3. Ion-exchange chromatography
4. Size exclusion chromatography

ข้อเด่นของ HPLC รุ่นนี้ สามารถแยกสารที่ปริมาณมากกว่า HPLC ทั่วไปได้ เพราะมีระบบ semi-prep ซึ่งเป็นการแยกในระดับกึ่งเตรียมตัวอย่างได้

ในการใช้เครื่องมือผู้ใช้งานควรมีความรู้เบื้องต้นเกี่ยวกับหลักการพื้นฐาน ส่วนประกอบของเครื่องมือและหน้าที่ของส่วนประกอบต่างๆ ซึ่งจะทำให้เข้าใจการทำงานของเครื่องมือ และใช้เครื่องมือได้อย่างรวดเร็ว มีผลการทดลองที่มีความถูกต้องและแม่นยำ  นอกจากนั้นยังเป็นการลดความเสียหายอันเกิดจาก การใช้เครื่องมือที่ผิดวิธี หากเกิดปัญหาในการใช้เครื่องมือ ให้ติดต่อเจ้าหน้าที่ทันที

คู่มือการใช้เครื่อง HPLC ฉบับย่อนี้จะเป็นแนวทางเบื้องต้นให้ผู้ที่มีความสนใจ สามารถทำตามและใช้เครื่องมือได้อย่างง่าย ซึ่งเป็นพื้นฐานในการพัฒนาการใช้ให้มีความชำนาญขั้นสูงขึ้นโดยศึกษาเพิ่มเติมจากคู่มือฉบับเต็มรูปแบบเป็นภาษาอังกฤษ และทดลองปฏิบัติควบคู่กันไปจะนำสัมฤทธิ์ผลมาสู่ผู้ปฏิบัติได้เป็นอย่างดี หัวข้อที่เกี่ยวข้องประกอบด้วย 4 หัวข้อ ได้แก่ การเตรียมตัวอย่าง การเปิดเครื่อง การใช้ software และการปิดเครื่อง

1. การเตรียมตัวอย่าง

ตัวอย่างที่นำมาวิเคราะห์จะอยู่ในรูปของของเหลว วิธีการเตรียมขึ้นอยู่กับชนิดของตัวอย่าง อ้างอิงจากวิธีการที่เป็นมาตรฐาน โดยทั่วไปแล้วจะต้องสกัดสารตัวอย่างก่อนนำมาวิเคราะห์ ตัวอย่างและสารละลายทั้งหมด จะต้องกรองด้วยเมมเบรนขนาดรูพรุน 0.45 um ก่อนนำมาวิเคราะห์

2. การเปิดเครื่อง

2.1 เปิด stabilizer (จะมีเสียงดัง ให้กดปุ่มสีเขียวเสียงจะหายไป) เครื่องพิมพ์ ปลั๊กรวมด้านหลังเครื่อง UPS คอมพิวเตอร์

2.2 เปิด detector มี 2 ชนิด ด้านบนเป็น RI detector ด้านล่างเป็น UV detector เปิดเฉพาะ detector ที่จำเป็นต้องใช้งาน เปิด pump water 600 และเปิด แก๊ส Helium

2.2.1 กรณี run แบบ semi-prep ต้อง เปลี่ยน flow cell ของ UV detector ให้เหมาะสม ซึ่งจะมีขนาดของ flow cell ใหญ่กว่า หากใช้ RI detector ให้ต่อท่อลดปริมาตรของ mobile phase ให้ถูกต้อง ก่อนต่อเข้ากับ RI detector ไม่เช่นนั้น detector จะเสียหายได้

2.2.2 การตั้งค่า UV detector ก่อนใช้งาน หลังจากเปิดเครื่องแล้ว

2.2.2.1 data not found กด enter(¿) , system not calibrate, enter , warm up 5 นาที

2.2.2.2 method not found, enter(¿), error, กดปุ่ม shift , กดปุ่ม calibrate, enter(¿), calibrate successful, enter(¿) เครื่องจะแสดงค่า Absorbance ทศนิยม 4 ตำแหน่ง ข้อความ <error> จะหายไป

2.2.3 การตั้งค่า RI detector ก่อนใช้งาน

2.2.3.1 หน้าจอแสดง non-volatile RAM ¿, LED intensity too low ¿ (ค่านี้จะขึ้นมาเรื่อยต้องกด ¿) จึงจะสามารถทำขั้นตอนอื่นได้ , factory default set ¿ จะตั้งค่าอีกครั้งในขั้นตอนที่ 3.7

3. การตั้งค่าต่างๆ ก่อนการใช้งาน

3.1 การเปลี่ยน mobile phase ให้นำท่อที่มีชุดกรอง จุ่มลงไปใน mobile phase ที่ต้องการและสังเกต ตัวอักษรภาษาอังกฤษ A B C และ D ที่ท่อ แสดงถึงการความสัมพันธ์ระหว่างท่อกับปั้ม

3.2 ที่หน้าจอควบคุมปั้ม กด direct เลือกปั้มให้ตรงสายท่อที่จุ่มลงใน mobile phase และตั้งค่า 100% ปั้มอื่นๆ ให้ตั้งค่า 0% หรือตั้งค่าตามต้องการ (หาก run เป็นแบบ gradient) หลังจากตั้งค่าเสร็จให้ enter เพื่อรับค่าที่ตั้งไว้

3.3 ตั้งค่า flow rate  1.0 ml/min และกดปุ่ม enter แล้ว กด stop flow หลังจาก run ไปแล้วประมาณ 30 วินาที

3.4 ใช้ syring ดูด mobile phase ออก เพื่อใล่อากาศในท่อ ในตำแหน่ง draw และปิดในตำแหน่ง run เพื่อนำ mobile phase ทิ้ง ทำเช่นนี้ 3 ครั้ง

3.5 ตั้งค่า flow rate 1.00 ml/min กด enter และ เปิดปุ่ม purge เพื่อไล่อากาศออก ประมาณ 2 นาที ปิปุ่ม purge และ stop flow จากนั้นนำสายที่ mobile phase ออกจากปั้มต่อเข้ากับ guard column, column HPLC และต่อเข้ากับ detector ตามลำดับ

3.6 ทดสอบการไหล และตรวจสอบข้อต่อต่างๆ ว่ามีการรั่วหรือไม่ โดยการตั้งค่า flow rate เท่ากับอัตราการไหลที่ต้องการ เช่น 1.00 ml/min โดยค่อยๆ เพิ่มอัตราการไหลที่ละ step ดังนี้ 0.2 0.5 0.8 1.0 ml/min (step ละ 1 นาที)

3.7 กรณีใช้ RI detector (ต่อจาก 2.2.3.1) ปล่อยให้ mobile phase ไหลผ่านประมาณ 10 นาที ที่หน้าจอยังขึ้น LED intensity too low ¿, กดปุ่ม shift purge ปล่อยให้ mobile phase ไหลผ่านอีกประมาณ 10 นาที กด shift purge ซ้ำอีกครั้ง, กด shift configure, ใช้ลูกศรเลื่อนมาที่ inject, กด 1(high) ¿, และกดปุ่ม HOME

4. การใช้ software และการวิเคราะห์ตัวอย่าง

ก่อนเข้า software ให้ set up เครื่องคอมพิวเตอร์ก่อนโดยกด F10, เลือก standard CMOS กด enter, เลือก IDE primary master กด enter, เลือก IDE HDD auto detect กด enter  กด F10 พิมพ์ Y และกด enter หลังจากตั้งค่าเสร็จแล้ว เครื่องจะ boot เข้ามาที่ windows XP

4.1 ที่หน้าจอคอมพิวเตอร์ click HPLC และ double click ที่โปรแกรม empower login

4.2 ใส่ค่า username เป็น system และ psw เป็น manager เลือก advance, quick start, click OK

4.3 select project system เลือก project และ detector ที่ต้องการใช้งาน และ click OK

4.4 click เมนู method set, file, open , เลือก method set ที่ต้องการใช้งาน, open

4.5 click เมนู instrument, file, open, เลือก instrument ที่ต้องการใช้งาน, open

4.6 click ปุ่ม equilibrate, เลือก instrument, click equilibrate/monitor และ click control panel เพื่อดูโครมาโทแกรม รอจนกระทั่ง baseline คงที่

4.7 click ปุ่ม inject ตั้งค่าการ inject ดังนี้

ตั้งชื่อตัวอย่าง เลือก method set ที่ต้องการ , พิมพ์ inject volume 100 ul, run time เลือกเวลาที่ต้องการ run ตามต้องการ แล้วกดปุ่ม inject

4.8 เครื่องจะขึ้นหน้าจอ pop up แจ้งให้ผู้ใช้งานฉีดตัวอย่างเข้าเครื่อง (load) เลือกช่องที่ใช้ฉีดให้ถูกต้อง (ช่อง analyte ใช้ในการแยกสารตัวอย่างที่มีปริมาณน้อย และ semi-prep ใช้ในการแยกสารตัวอย่างที่มีปริมาณมาก) หลังจากนั้นให้เลื่อนตำแหน่งมาที่ inject หน้าจอ pop up จะหายไป รอจนกระทั่งถึงเวลาที่ตั้งไว้ (injection complete) จึงจะสามารถฉีดตัวอย่างต่อไปได้

4.9 การพิมพ์ผลการทดสอบ

4.9.1 เลือก browse project, result, เลือก file ที่ต้องการ (หากไม่พบ file ให้เลือก tab inject, update แล้วเลือกไฟล์ที่ต้องการ click mouse ขวาที่ไฟล์ เลือก process, OK เลือก tab result, update) เลือกไฟล์ที่ต้องการพิมพ์ผล  click ปุ่มขวาที่เมาส์ เลือก preview, เลือก use the following report method, เลือก default individual report, click OK, เลือกเมนู file และ print chromatogram ออกมา

5. การปิดเครื่อง

5.1 กด stop pump ที่หน้า control panel, ปิดโปรแกรม empower, ปิดหน้า processing และ shut down computer และถอดการ์ดคอลัมน์ และคอลัมน์ออก ปิดคอลัมน์ด้วย nut พลาสติกให้เรียบร้อย

5.2 ดึงสาย pump ที่จุ่มลงใน mobile phase ให้อยู่เหนือระดับสารละลาย

5.3 ดูดสารละลายที่อยู่ในท่อออกให้หมด โดยใช้ syringe ดูดออกที่ตำแหน่ง draw หลังจากดูดออกหมดแล้วให้หมุนมาที่ตำแหน่งเดิม(run)

5.4 ล้าง sample loop ด้วยน้ำกลั่น โดยฉีดน้ำกลั่น 2-3 ครั้งเข้าไปในเครื่องที่สวิทซ์ inject ในตำแหน่ง load

5.5 ปิดแก๊ส He, ปิดสวิทซ์ปั้ม water 600, ปิดสวิทซ์ detector, ปิด UPS computer, ปิด printer, สวิทซ์รวม (ด้านหลังเครื่อง computer) และปิด stabilizer

5.6 ลงบันทึกการใช้เครื่องมือทุกครั้ง

5.7 จัดเก็บทำความสะอาดเครื่องมือ อุปกรณ์ที่เกี่ยวข้อง และบริเวณที่ใช้งานให้เรียบร้อย

5. หนังสืออ้างอิง

6.1 คู่มือการใช้เครื่อง HPLC ยี่ห้อ  Water รุ่น 600

6.2 หลักการและเทคนิคการวิเคราะห์เชิงเครื่องมือ. แม้น อมรสิทธิ์ และ อมร เพชรสม. พิมพ์ครั้งที่ 1 พ.ศ. 2535.

Created by benzene                                                                                                        20 July 2009